venerdì 19 marzo 2010

fisica degli acidi nucleici - DNA, RNA, LNA

Questo mese esce il quinto numero del Carnevale della fisica, pubblicato sul blog di Annarita Ruberto, molto apprezzata per i suoi interventi sulle scienze, matematica (varie edizioni del carnevale della matematica).
Riprendo quindi il tema di alcuni post passati introducendo studi di fisica del DNA e dell'RNA, i due acidi nucleici che contengono l'informazione genetica, e su come si sono ampliate la nostre conoscenze nel corso degli ultimi anni, grazie ai contributi di biologi, medici e fisici.

Locked Nucleic Acid
Gli acidi nucleici sono costituiti da mattoncini qui schematizzati composti da uno zucchero, una base azotata e dei legami esteri tra gli zuccheri successivi. l'RNA ed il DNA si differenziano perchè nel DNA l'acido deossiribonucleico è privo dell' idrossile OH in 2' sul ribosio. La base azotata può essere una delle 4 presenti: timina (o uridina nell'RNA), guanina, adenina o citidina. Grazie a questi appaiamenti tra basi che si affacciano sui 2 filamenti di una doppia elica, avviene il riconoscimento tra un DNA ed il suo complementare, o tra un DNA ed un RNA complementare.
Lo studio degli acidi nucleici si è avvalso dell'apporto dei fisici che ne hanno studiato il comportamento in soluzione, in presenza di un doppio filamento, e di come la doppia elica si comporta diversamente tra DNA ed RNA. I primi dati sono stati ottenuti mediante l'analisi di diffrazione ai raggi X (Patterson) sui due filamenti orientati in direzione opposta, e in seguito da Wilkins (1953). Nello stesso anno uscì il lavoro con i dati di Watson e Crick. La cristallografia, che in genere si applica a strutture che sono state costrette a formare cristalli, è stata applicata anche a confermare i patterns di struttura delle fibre di DNA, che racchiudono un parziale ordine interno.
Anche le misurazioni di Vibrational optical activity, un particolare ramo di Dicroismo circolare vibrazionale (VOA misura lo stiramento tra carbonio e idrogeno in presenza di acqua triziata) è stato utilizzato per misurare polimeri complessi come gli acidi nucleici.

Introduzione di analoghi dello zucchero e nuovi acidi nucleici di sintesi.
Nell'LNA è presente uno zucchero modificato ciclico, Locked, con un legame interno tra l'ossidrile in 2' ed in 4'. La presenza di questo zucchero bloccato nei movimenti nell ospazio conferisce proprietà particolari ai filamenti di oligonucleotidi contenenti LNA
Un filamento di DNA contenente LNA sottosta ad una limitazione fisica di movimento che costringe l'acido nucleico ad assumere una conformazione rotazionale identica a quella propria dell'RNA (a destra).

Immagine tridimensionale elaborata sulla base della struttura ottenuta con le analisi fisiche

Gli oligonucleotidi contenenti LNA obbediscono alla regola di appaiamento di Watson-Crick (T-A, G-C), posseggono elevata affinità di formazione di doppia elica (T melting = +2 - 8’C per base), così che il filamento
- si ibrida facilmente e stabilmente con una sequenza complementare di RNA
– Migliora la specificità di appaiamento tra le basi azotate nell'ibridazione
gli oligonucleotidi contenti LNA, quando si legano con l'RNA, la fanno con più alta specificità e sensibilità nei saggi sull'RNA (Northern blot, ibridizzazione in situ) che possono essere condotte a temperature elevate proprio per quegli 8 gradi in più rispetto ad un acido nucleico tradizionale.
L'LNA viene sintetizzato come mattoncino per produrre, mediante sintesi chimica di oligonucleotidi, filamenti di DNA dopati RNA-like. Gli oligonucleotidi così ottenuti sono usati in DNA microarrays (MicroRNA array), o come sonde per ibridazione in tessuti e su membrana.
Un evento che ha determinato il successo della Exiqon è stato la scoperta che gli oligonucleotidi non devono contenere troppi LNA, perchè diventano idrofobici, e precipitano in soluzione. La Exiqon da allora sintetizza oligonucleotidi con pochi LNA distributi ogni 4-5 basi azotate, e questo è sufficiente per dare solubilità ed anche specificità di ibridazione con sequenze complementari.
Chi produce ed ha il brevetto degli LNA è una azienda danese, nata nel 1996.

La Exiqon, sotto la guida scientifica di Sakari Kauppinen, ha partecipato a diversi progetti europei tra il 2003 ed il 2006 (Riboreg, GOCE fish-and-chip), e mediante colaborazioni internazionali (Ronald Plasterck)ha dato la prima prova che l'espressione di singoli microRNA è tessuto specifica che si succedono o sovrappongono durante lo sviluppo ed il differenziamento in zebrafish (immagine ripresa da Wienholds et al. Science 2005).

Oggi l'Exiqon è il fiore all'occhiello della Comunità Europea, indicata come una azienda di successo che è cresciuta dai Programmi Quadro di ricerca europea, anche se lo sarebbe diventata a prescindere. Infatti, già nel 2006 avea originato la Santaris, finalizzata alle applicazioni terapeutiche di oligonucleotidi (trials clinici nei tumori e nelle malattie degenerative, come antiMiRs e anti-Bcl2).


In questi anni sono stati determinanti i progressi nella strumentazione per l'analisi degli acidi nucleici, che permettono di risparmiare sulle quantità necessarie. Nei primi anni fino al 2005, si doveva partire da qualche microgrammo di RNA totale per accedere all'espressione differenziale, oggi con uno spettrofotometro a contatto, usando solo un microlitro di RNA, già se ne conosce la purezza e la concentrazione. Con altri accorgimenti (amplificazione lineare dell'RNA messaggero o adattatori sui microRNA) si riesce a lavorare con 50-100 nanogrammi.
Gli spettrofotometri sono strumenti che leggono, (mediante un monocromatore che scompone la luce mediante filtri), l'assorbimento e l'emissione di luce di una soluzione, lungo uno spettro che va dai raggi UV (dai 210 nanometri fino a 400 nanometri) alla luce visibile (fino a 750 nanometri). Nel link è riportata l'equazione che lega il valore di emissione alla concentrazione del soluto, data dalla legge di Lambert e Beer. Il passo in avanti rispetto ai vecchi spettrofotometri è stato di evitare l'uso della cuvetta di quarzo, che può contenere almeno 50 microlitri, e di passare alla lettura a contatto, riducendo i volumi di RNA consumato di 50 volte.
Il risultato di questa analisi è dato dal valore di emissione a 280 nm, in cui assorbono sia gli acidi nucleici che gli amminoacidi aromatici, ed il valore di assorbimento a 260 nm, proprio degli acidi nucleici. Negli anni '90 e anche dopo, quando ancora non si avevano a disposizione questi strumenti, si valutava la concentrazione (per concentrazioni basse di DNA o RNA, sotto la soglia di rilevazione dello spettrofotometro) mediante corsa su gel di agarosio e estrapolazione per paragone cun i DNA markers di diverso peso molecolare.

Alcuni cenni su scoperte e su 2 grandi ricercatori dell'RNA nella riboregolazione

Joan Steitz (Prof. J. Argetsinger-Steitz, Yale Univ.) è una delle grandi pioniere della ricerca sull'RNA, RNA dei complessi riboregolatori (Ribonucleoproteine), e non-coding RNA piccoli come i microRNA. Trent'anni addietro quando separava l'RNA totale sui gel di acrilammide, osservava sul fronte di corsa dei piccoli RNA marcati (radiattivi), che venivano considerati come prodotti di degradazione, e lasciati eluire.
Da una sua intervista e Epigenie:
"Steitz: I think the most interesting finding was the RNA stuff that run at the front of our polyacrylamide gels. We were all labeling cells with P32 and getting incorporation and then running gels that would fractionate small RNAs. There was always this big band right at the front of the gel, and we said, “Oh, that's a degradation product.” But that isn't what it was. It was really mostly microRNAs, and some degradation products. Then people switched to indirect methods, like Northern blots, where you only find what you're probing for, and since they weren't probing for the stuff at the front of the gel, microRNAs went another two decades without being discovered".

Un altro grande appassionato di RNA è il Dr. George Calin, uno dei pionieri degli onco-MiRs, i microRNA riboregolatori che controllano lo sviluppo dei tumori, in particolare del sangue. Ha studiato in Romania, sua terra d'origine, ed ha preso e svolto il dottorato presso il laboratorio del Dr. Massimo Negrini, Università di Ferrara, prima di emigrare negli Stati Uniti, al Kimmel Cancer Center di Philadelphia, PA, presso il laboratorio del Dr. Carlo Croce. Una grande soddisfazione per la ricerca italiana in Italia e all'estero.
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