breve visita in Austria

Dal 2 al 6 luglio ho visitato Salisburgo per una pausa dal lavoro ma anche per un convegno sugli RNA.

Ho soggiornato a Wals, un paese vicino all'aeroporto, alloggio che  ho trovato tramite AirB(and)B, un servizio di affittacamere online che gestisce una munitissimo numero di locatari sparsi per il mondo : il posto scelto era a 30 euro al giorno, e dispone di una mansarda grande due stanze, e di un bagno alla discesa delle scale fornito di doccia, lavatrice e asciugabiancheria, servito da due autobus che fanno la spola fino al dopo le 21 con la città. 

                                           panorama dalla finestra della mia mansarda

Arrivato da Bologna in treno, ho goduto del servizio e delle comodità, ho anche consumato un pasto (che ho provveduto a mettere nella borsa perchè a Innsbruck non c'era tempo per scendere dalla piattaforma).

(treni efficienti, senza ostacoli per disabili, con servizi per biciclette e nuove carrozze)

l convegno si svolgeva sulla collina, tra villette residenziali, presso l'hotel Saint Virgil (si legge Virghil), un istituto salutistico e religioso che fornisce una buona cucina, un ambiente tranquillo, filosofico e olistico,  nel verde

La mattina per i primi due giorni ho preso un autobus per arrivare a san Virghil, e al ritorno sono sceso a piedi.  Avendo imparato il percorso, il terzo giorno sono salito a piedi, investendo i 2,5 euro in un caffè sulla terrazza. La mattina presto il lungo fiume è animato da persone che fanno jogging e esercizi, oltre a chi cerca monete e oggetti preziosi con i metal detector (sedersi sugli argini come fanno i giovani nel pomeriggio comporta il rischio che le monete cadano dalle tasche).

Il costo della vita è rapportabile a quello di una nostra grande città, si riesce a mangiare ai chioschi o in posti a gestione familiare con 3,5 euro, esempio ho preso una vellulata di patate, un caffè e una fetta di torta alle mele per 7 euro.

Il mio padrone di casa, un ragazzone alto e sportivo, con cui mi sono intrattenuto a parlare una sera, e che ha lavorato diversi anni in Italia, come istruttore sportivo e cameriere a Rimini, e maestro di vela sul lago di Garda, ha detto che vanno una volta su tre a fare la spesa in Germania, rispetto a Salzburg è a pochi chilometri, (la mattina gli sms mi indicavano di essere sotto le linee dei provider tedeschi) e per molti prodotti c'è una differenza di un  euro, che sulla lista finale della spesa fa una bella differenza.

La sua passione è la montagna, passare un weekend in tenda con gli amici, organizzare salite sulle Alpi bavaresi e salisburghesi, il picco delle aquile di hitleriana memoria è a distanza di qualche ora. Purtroppo spesso il sabato c'è pioggia o maltempo, così si accontentano di escursioni più brevi. 

                                      particolare di una strada del ghetto, via dei Giudei

                                           alle spalle della piazza della città vecchia

                             con la casetta più stretta, costruita per colmare un vicolo tra due palazzi

                                    con la statua di San Florian, e la farmacia più antica

Senza parlare di tutti i riferimenti a Mozart, le piazze, alle case con targhe "qui ha abitato ...", al Flauto Magico e la piazza  Papageno, i ristoranti Pamina, i musei e l'auditorium di musica classica... tantissimi  luoghi

A me piacciono le piazze con i mercatini, e qui anche se più a livello di boutique dell'ortofrutta, si trovano tante verdure tipiche mitteleuropee, il cavolorapa, che si mangia sia fresco, affettato, che stufato  in umido e nelle minestre, la radice di prezzemolo, che dà un sapore particolare allo spezzatino e all'arrosto di carni miste con la panna acida, il rafano, che è aggiunto sia grattugiato che in forma di crema a wurstel, carne lessa di maiale, cotolette e wiener schnitzel. 

Una sosta  fruttuosa è stata al supermercato, mi sono rifornito di semi di cumino dolci e quelli più aromatici, adatti per cucinare i crauti, bacche di ginepro, pane di tipo tedesco, schwarz brot (al cumino).

Altra tappa in macelleria, a acquistare rauch schunken, la carne affumicata che si usa sia cruda che arrostita, e la pasta di wurstel spalmabile, che in Cechia chiamiamo macesky, in tedesco teewurst.

L'Austria è stata una seconda patria per mia madre, già operaia in fabbrica a Vienna a 18 anni, nel 44-45, vi sarebbe rimasta con il nonno non fosse stata la nonna a voler tornare  al paese a Dobrin. Vi è sempre tornata con entusiasmo, parla ancora bene il tedesco, ha nostalgia della cucina e dei dolci.

E' stato tutto un parlare a monosillabi, danke, nach, bitte, dato che il mio corso di tedesco risale alla seconda media, e ho perso l'uso dei verbi, ma l'inglese è lingua simile e compresa da tutti

   Targa commemorativa dello scienziato  fisico Doppler, nella piazza dedicata a Mozart

                                

Ma tutto questo tempo non è stato dedicato solo a mangiare...

in sede di convegno, ho incontrato Corrado Spadafora, a desrtra nella foto, ora dirigente all'Istituto Superiore della Sanità, protagonista di uno dei temi più controversi nella ricerca, il trasferimento di materiale genetico non-self mediante spermatozoi e la produzione di animali modificati per la zootecnia. Come ci tiene a precisare, questo DNA estraneo (nella forma di un gene che rende le cellule fluorescenti) si può trovare in cellule a mosaico in vari  tessuti, ed è trasmissibile solo per 2-3 generazioni. Quindi è un metodo inadatto alle esigenze di modificare una razza animale per fini industriali o di ricerca (vedi post precedente, Marialuisa Lavitrano e i maiali modello di malattie genetiche e per la sperimentazione di farmaci). Invece, attualmente si occupa di espressione di elementi ripetuti di origine virale e retrotrasposoni in cellule embrionali e tumorali. Il suo obiettivo, riuscire a fare dei trials clinici con un farmaco inibitore della trascrittasi inversa (già in uso per la terapia anti-HIV) sui malati di tumore anche in presenza di metastasi. Infatti i suoi dati mostrano uno spiccato effetto inibente nei tumori trapiantati in topo.

Un caro amico, una brillante e vivace mente, è Guenther Kahl, al centro, Professore Emeritus alla Goethe University a Francoforte, e socio fondatore della GenXpro. Ci ha lasciato nel 2016. Era settantenne, ha scritto libri e Enciclopedie di genomica, su SuperSAGE, Deep sequencing, Transcriptome profiling, l'ultimo dei quali in collaborazione con un collega tedesco al RIKEN, sulle metodiche di tagging (aggiunta di elementi di identificazione di frammenti di cDNA) e Next generation sequencing. Il suo più bel complimento è l'aver riconosciuto nei nostri colloqui che non sono  monotematico, mente pensava che io mi occupassi solo di piante (legumi) e risposta agli stress. Una soddisfazione è quella di aver trovato altri contributori per uno special issue sugli RNA: signaling, structures and role in protein complexes, che uscirà su MicroRNA nel 2015.

La chimica del Priming

Il Carnevale della Chimica n. 26 è in uscita in 23 marzo sul blog di Teresa Celestino "Pensieri in provetta",  si parlerà di “Chimica della difesa”, e dei meccanismi molecolari e sistemi di segnale utilizzati per fronteggiare agenti esterni dannosi per la salute dell’organismo, nell'uomo, nel mondo animale e nelle piante.

In questo post tratterò di ormoni vegetali, uno dei temi del mio lavoro di ricerca sulle piante, di meccanismi di riconoscimento di prodotti estranei (proteine e polisaccaridi) di funghi, batteri e virus (stress biotici),  dal rilevamento dell'ospite fino allo scatenamento di una risposta efficace e di segnali di memoria nelle piante.

L'acido jasmonico, estratto per la prima volta da arbusti di gelsomino (da cui il nome) e presente in altre specie di piante,   è un ormone vegetale 

Sintetizzato a partire dall'acido linoleico (tramite lipossigenasi, allene ossido sintasi e allene ossido ciclasi, e acido ossifitodienoico riduttasi), è implicato tra l'altro nella difesa contro stress fisici (ferite), chimici (ozono) e biotici (insetti, funghi,  e batteri patogenici e avirulenti). La sua presenza comporta la sintesi di proteine quali: difensina, tionina e chitinasi, che determinano la resistenza sistemica indotta (ISR). L'acido jasmonico ed alcuni suoi derivati (jasmonato di metile, MeJA), sono utilizzati come elicitori, ossia agenti in grado di indurre nelle piante,  la produzione di metaboliti secondari implicati nella difesa chimica, e la modificazione della parete cellulare (deposizione di callosio e pectina).

La memoria epigenetica (da una generazione alle altre) mediata dagli ormoni passa attraverso la metilazione del DNA, la trascrizione di RNA non codificante (small RNA, ncRNA), e la modificazione psot-traduzionale degli istoni.

Il metil-jasmonato è un composto volatile, che penetra la membrana, produce l'effetto tipico dell'acido jasmonico, ed è usato come iniziatore chimico della risposta jasmonato-mediata. Il derivato dell'acido jasmonico che è attivo nella pianta è il suo coniugato con un amminoacido, jasmonoil-isoleucina (JA-Ile). Il JA-Ile si lega ed è riconosciuto dal complesso SCF, formato da una proteina F-box a da COI1, il recettore di JA-Ile, una E3 ubiquitina ligasi, che trasferisce ubiquitina sul F-box e la destina alla degradazione proteolitica. Questo segnale permette la liberazione del fattore di trascrizione MYC, che è il vero effettore e media l'azione del jasmonato aumentando l'espressione di vari prodotti genici (defensine, inibitori di proteine, ecc..). 

La coronatina è una fitotossina prodotta da batteri Pseudomonas syringae, che mimica il JA-Ile e la sua azione su COI.  E' coinvolta nella riapertura degli stomi  dopo che questi sono stati chiusi in risposta al segnale della piante che ha sentito la presenza batterica ed interferisce cn le risposte  mediate da un altro ormone, l'acido salicilico, in seguito all'infezione. 

Wounding: la ferita da insetti stimola la produzione di VOCs, composti volatili (terpeni, aldeidi) che attraggono insetti antagonisti

Acido salicilico (SA)

SA è conivolto nella propagazione del segnale tra i veri tessuti, e media  la difesa contro i patogeni, inducendo la sintesi di proteine PRP

(pathogenesis-related proteins), ed è  coinvolto nell'instaurarsi della resistenza sistemica acquisita (SAR)

Il segnale è in grado di trasferirsi alle piante vicine, mediato dall'estere volatile metil salicilato.

Sistemina

Nel 1991, è stato scoperto un peptide di 18 amminoacidi ricco in idrossiprolina che è un segnale mobile nelle foglie del pomodoro, che induce proteine come gli inibitori di proteasi  (PIs) in risposta al wounding, la percezione delle ferite.  Questo peptide nelle Solanceae è idrossilato e glicosilato. Nel 2006, è stato isolato un altro peptide, AtPEP1, di 23 amminoacidi che attiva i componenti della risposta immune,. privo di idrossilazione e glicosilazione.  La sistemina è il mediatore della risposta all'acido salicilico.

La risposta ipersensibile (HR)  è la prima fase localizzata dell'attacco patogeno, spesso viene seguita da un evento necrotico localizzato che serve a contenere la diffusione del patogeno.

JA) e  etilene (ET) giocano un ruolo importante nella risposta allo stress biotico da patogeni necrotropi, le loro vie di segnale sono sinergiche e confluiscono su una classe di fattori di trascrizione che rispondono a entrambi gli ormoni, Apetala/etilene responsive element factor, o AP/ERF. Questi fattori di trascrizione riconoscono nei promotori target le sequenze GCCGCC, nei geni inducibili PR (patogenesis related).

Elementi che scatenano il riconoscimento di un organismo estraneo sono i PAMP ossia pathogen-associated molecular pattern, come il flagello  ed il Recettore della flagellina, i polisaccaridi fungini, chitina e galattomannani e il loro recettore, LPS, peptidoglicani, eccetera.

I recettori per questi elementi estranei sono composti da una parte extracellulare LRR (Leucine rich repeat) ed una intracellulare (Receptor like kinase), oppure quelli del tipo NBS-LRK. LA regione LRR è importante nel sensing immunitario in tutti gli organismi, è prsente anche nei pesci, come la lampreda, è fornisce una ipervariabilità di combinazioni simile agli anticorpi, nel senso che sono in grado di formare n-tipi di strutture adattabili ad n-tipi di antigeni.

PAMP e immunità scatenata da PAMP (PTI) 

Le piante rispondono a questi PAMP mediante Proteine PR i resistenza alla malattia.    Il segnale dato da SA ferma la crescita e stimola la risposta  immune.  Gran parte dei geni indotti da SA  ano sotto il controllo di NPR1. NPR1 normalmente è presente come oligomero collegato da ponti disolfuro nel citoplasma. In seguito ad SA, gli oligomeri NPR1 vengono liberati dall’azione dei riducenti intracellulari. NPR1 si lega direttamente ad SA mediante gruppo prostetico (ioni rame) con due residui di cisteina.
 

AFM: actinomycorriza, funghi e batteri associati, sono spesso simbionti (collaborazione benefica per entrambi i partners) in molte piante hanno un effetto benefico sull'adattamento a stress biotici ad abiotici (siccità, sale, caldo, freddo e ioni tossici).

Questi microrganismi producono ormoni (etilene, acido jasmonico, auxine, acido abscissico) sostanze patogen oantagoniste, e composti chimici che influenzano l'attvità romonale dell'etilene, delle citokinine, gibberelline, acido salicilico, ecc...

• In P. indica, a component in the exudates of the fungal hyphae was found to induce root growth (Fassner 2012). Ethylene-responsive genes are repressed in P. indica-colonised barley roots (Schäfer et al. 2009). Considering that some rhizobacteria produce enzymes that degrade ethylene, the P. indica compound seems to inhibit ethylene signalling

Un effetto benefico è stato scoperto dall'applicazione di un amminoacido non naturale, l'acido D-betaamminobutirrico (BABA, enantiomero specifico).

• BABA not only mimics SAR-related priming by potentiating SA-inducible defences, but also primes pathogen-induced deposition of callose-containing papillae, which functions independently of SA and JA, but requires intact biosynthesis and perception of the plant hormone abscisic acid (ABA)

Il priming, o precondizionamento dei tessuti per una efficiente attivazione dei meccanismi di difesa,  si avvale o di composti mimetici di ormoni, o di sostanze che influenzano la sintesi o il catabolismo degli ormoni stessi.

Il Bion (Syengenta) è un prodotto commerciale analogo dell'acido salicilico. il cis-3-hexenyl-acetate (Z-3-6:AC) aumenta la sintesi di acido jasmonico ed è usato per indurre priming nel mais.

Il probenazolo è stato studiato nel priming nel riso. N altro interessante composto efficace nel priming è l'acido 4-clorobenzoico e la sua azione sul recettore dell'acido salicilico.

• Immune-priming chemicals such as probenazole help protect rice against infection, but leave other critical crops vulnerable. Pretreatments increased the accumulation of endogenous SA, but reduced its metabolite, SA-O-β-D-glucoside. Inducing compounds inhibited two SA glucosyltransferases (SAGTs) in vitro.
• ImprimatinC1 acts as a functional analogue of SA, but only partially mimics SA action.
• ImprimatinC1 confers disease resistance to Arabidopsis plants,  did not induce cell death without pathogen challenge.
• the synthetic auxin sirtinol also contains an imine bond and is hydrolysed after incorporation into cells. One of its metabolites, 2-hydroxy-1-naphthaldehyde (HNA), can then be catabolised by a moco-containing aldehyde oxidase to become the active molecule 2-hydroxy-1-naphthoic acid (HNC)
• imprimatinC1 may be broken into two smaller molecules and that 4-chlorobenzoic acid (4-CBA) might function as the active core of imprimatinC1. To test this possibility, we investigated whether 4-CBA can function as an immune potentiator
• Unlike imprimatinA and B, which target SA metabolism, imprimatinC compounds exhibit weak SA-analogous activity and induce the expression of defence genes independent of pathogen challenge. 

1.        Noutoshi, Y., Jikumaru, Y., Kamiya, Y. & Shirasu, K. ImprimatinC1, a novel plant immune-priming compound, functions as a partial agonist of salicylic acid. Scientific Reports 2, 705 (2012).

acidi nucleici

Nuove possibilità di produzione di oligonluceotidi di sintesi contenenti LNA, Locked Nucleic Acids, in cui esiste una struttura chiusa, locked,  con un legame ciclico tra il Carbonio in 2' e l'ossidrile sul carbonio in 4' nel ribosio dei nucleotidi di una molecola di DNA che dà una conformazione come se fosse di RNA. Nel DNA, l'acido deossiribonucleico è privo dell' idrossile OH in 2' sul ribosio, mentre negli LNA questo carbonio partecipa al legame con l'OH sul carbonio in 4'.

Sequenze conententi LNA sono molto utilizzate in biologia molecolare, in terapia clinica e per silenziare mRNA e microRNA.

Non ci sarà più bisogno di ordinarli dalla Exiqon o chi per loro abbia un licence agreement.

L'aticolo che descrive nuove DNA polimerasi con la capacità di sintentizzare queste sequenze e altre ancora (con nucleotidi con proprietà ancora da scorpire) è apparso oggi su Science

• Unnatural Bases
• The genetic basis of all life on the planet is comprised of deoxyribonucleic acid (DNA) with four nitrogenous nucleotide bases, abbreviated to A, G, C, and T. But there are variations on this theme, and Pinheiro et al. (p. 341; see the Perspective by Joyce) describe the directed evolution of unnatural nucleic acid-like genetic polymers. Variant enzymes were developed that efficiently transcribed DNA to anhydrohexitol (HNA), cyclohexenyl (CeNA), locked (LNA), and threofuranosyl (TNA) nuceic acid analogs. Further variant enzymes were developed to reverse-transcribe these analogs back to DNA. Thus, man-made nucleic acid analogs can be designed and selected that have the potential to operate in a way analogous to the natural process of heredity and evolution.
• Genetics provides a mechanism for molecular memory and thus the basis for Darwinian evolution. It involves the storage and propagation of molecular information and the refinement of that information through experience and differential survival. Heretofore, the only molecules known to be capable of undergoing Darwinian evolution were RNA and DNA, the genetic molecules of biology. But on page 341 of this issue, Pinheiro et al. (1) expand the palette considerably. They report six alternative genetic polymers that can be used to store and propagate information; one of these was made to undergo Darwinian evolution in response to imposed selection constraints. The work heralds the era of synthetic genetics, with implications for exobiology, biotechnology, and understanding of life itself.

In: Science, 20 April 2012: 341-344
Synthetic Genetic Polymers Capable of Heredity and Evolution
Vitor B. Pinheiro, Alexander I. Taylor, Christopher Cozens, Mikhail Abramov, Marleen Renders, Su Zhang, John C. Chaput, Jesper Wengel, Sew-Yeu Peak-Chew, Stephen H. McLaughlin, Piet Herdewijn, and Philipp Holliger

Epigenetica

L'Alba dell'Epigenetica

: 2001 ODISSEA NELLO SPAZIO DEL GENOMA

In una mattina di 6 anni fa, a Napoli,  dopo una visita in Università, via Mezzocannone, dai cui terrazzi si ha una vista panoramica sul golfo e sul Vesuvio, mi recai al CNR-IGB, Genetica e Biofisica (Buzzati-Traverso) in via Castellino. Qui l'allora responsabile di progetto, un giovane Valerio Orlando, da poco rientrato dalla riunione FANTOM 4 al RIKEN, sull'annotamento del nuovo genoma di topo, mi presentava le sue slides sulla funzione degli RNA non codificanti proteine, in particolare quelli delle regioni Homeobox (HOX). La prima diapositiva era questa

2001 ODISSEA NELLO SPAZIO DEL GENOMA

 in effetti in questi 5 anni si è rivelata una risorsa per la scienza europea, dai progetti Epigenome, networks of Excellence, ai progetti bandiera italiani con gruppi del CNR e di Telethon, guidato da Valerio Orlando.

• Istituto Dulbecco Telethon, Roma, Italia 

• Valerio Orlando, Presidente della Società di Biofisica e Biologia Molecolare, come tale partecipa al consiglio esecutivo della FISV (Federazione Italian Scienze della Vita).
• -1991-1997: lavora presso il Centro per la Biologia Molecolare dell’Università di Heidelberg nel laboratorio di Genetica Molecolare dello Sviluppo
• –1997-2001: coordina un gruppo di ricerca presso il DIBIT, Ospedale San Raffaele di Milano
•  lavora all’Istituto Internazionale di Genetica e Biofisica (IIGB) CNR di Napoli e studia i meccanismi molecolari alla base della capacità delle cellule di mantenere e trasmettere alle cellule figlie la propria identità, in particolare mantenendo lo stato di espressione attivo o represso dei geni che caratterizzano un particolare tipo cellulare.
• -ad oggi: Dulbecco Telethon Institute, Laboratorio di Epigenetica, ospitato dall'IRCCS Fondazione Santa Lucia e EBRI di Roma
• Attivando determinati sottoinsiemi di geni in cellule diverse e a diversi stadi di sviluppo è possibile conferire loro un'altra identità cellulare e funzioni differenti, nonostante le cellule contengano le stesse informazioni genetiche. Interferenze nel processo di attivazione possono causare anomalie dello sviluppo e il cancro. Le proteine dei gruppi Polycomb e Trithorax sono in grado di attivare e disattivare i geni durante lo sviluppo embrionale. Valerio studia le proteine del gruppo Polycomb in grado di silenziare i geni in maniera ereditabile tramite il controllo della struttura e delle dinamiche della cromatina. In particolare, questo team di ricerca si occupa del ruolo delle proteine del gruppo Polycomb e dell'RNA non codificante nel mantenere, e possibilmente riprogrammare, l'identità cellulare.

Gatti calico 

Guinness e Rainbow, gattini clonati

• Ho chiamato Guinness, come la famosa birra nera irlandese, il nostro ultimo gatto, perché le striature del suo mantello mi ricordavano le sfumature di una pinta di Guinness. Se avessi da parte 25.000 sterline e Guinness fosse ancora viva, prenderei in considerazione di farla clonare. Penso comunque che resterei un po' delusa dalla mia nuova gattina perché è alquanto improbabile che assomigli alla mia adorata micina. Il primo gatto clonato, Carbon Copy, è nato in Texas da una gatta calico come Guinness. Nonostante il nome, il nuovo gatto non si è rivelato una "fotocopia" della sua "mamma" genetica, Rainbow, nonostante il loro DNA sia identico. Ciò può in parte essere spiegato mediante un fenomeno epigenetico, noto come "inattivazione dell'X". I gatti calico sono sempre femmine, vale a dire che hanno due cromosomi X in ogni cellula. Il gene del colore rosso del pelo si trova sul cromosoma X, me ne esiste un'altra versione (allele) che dà luogo al pelo nero. Nei gatti di sesso femminile (XX), viene "spento" o represso un cromosoma X in ogni cellula. Pertanto, se una femmina eredita un allele di ciascun tipo (rosso e nero) avrà il manto a macchie di entrambi i colori.

• Il processo di inattivazione è casuale, ecco perché clonando un gatto calico non se ne otterrebbe mai un altro con il mantello uguale. Nel caso di Carbon Copy, la gatta è stata clonata da una cellula uovo il cui nucleo è stato sostituito con quello di una cellula di Rainbow. Sebbene la cellula con cui è stata clonata Carbon Copy avesse un cromosoma X inattivo, il programma di sviluppo riattiva entrambi i cromosomi X e il successivo processo di inattivazione è messo in atto in maniera casuale. Ne risulta un mantello completamente diverso, nonostante due individui siano geneticamente identici.

•  La mamma è tutto

  I leoni maschi in cattività si accoppiano anche con tigri femmine. Da questa unione nascono dei ligri, che con la loro lunghezza di oltre 3,5 m e un peso doppio rispetto a quello dei genitori, fanno sembrare tigri e leoni dei gattini. Se invece ad accoppiarsi sono una tigre maschio e un leone femmina, l'incrocio che ne risulta, ovvero un tigone, è molto più piccolo. Perché i ligri sono così grandi e i tigoni così piccoli? Perché, se si accoppiano una tigre e un leone, è importante quale dei due sia il padre e quale la madre? Dalla biologia non abbiamo forse imparato che entrambi i genitori forniscono lo stesso contributo genetico? Effetti simili si ottengono incrociando una cavallo e un asino. Il mulo nato da una giumenta e da un asino è visibilmente diverso da quello nato da un'asina e da uno stallone. È chiaro che i genitori hanno un influsso diverso sulle modalità di funzionamento dei geni. 

  

   Hercules, il ligre

• Premio Nobel all’ epigenetica Che cosa hanno in comune la petunia e il millepiedi ? Alla vista appaiono diversi, al tatto sono diversi, all’olfatto odorano diversamente…o perlomeno una persona penserebbe così. Entrambi i sistemi però hanno portato gli scienziati a scoprire un nuovo modo di spegnere l’espressione genica. La natura si serve di numerosi metodi per silenziare i geni, un mezzo molto astuto che permette allo stesso genoma di usufruire di molteplici modi di espressione, o epigenomi in un unico organismo. Uno di questi trucchi, l’ interferenza a RNA, (RNA interference) è diventato di dominio pubblico da quando Andrew Fire (Stanford, CA) e Graig Mello (Massachuttes, MA) hanno ricevuto in modo congiunto il premio nobel per la medicina grazie al loro lavoro sull’azione dell’ interferenza a RNA nel verme Caenorhabditis elegans. Una lettera spedita alla rivista Nature nel 1998, ha rivelato la loro eclatante scoperta. 

•  Premio Nobel per la trascrizione (una famiglia con 2 premi Nobel) Grazie a scienziati come Roger Kornberg, che ha ricevuto il premio nobel del 2006 per la chimica, cominciamo ad avere le idee più chiare su cosa accade nel nucleo e come miliardi di metri di DNA nel nostro corpo sono convertiti in RNA da un enzima che si chiama RNA polimerasi II. Roger Kornberg ha condotto studi scrupolosi sui micromeccanismi della trascrizione.  Ispirato dal padre Arthur Kornberg che ha meritato il premio nobel nel 1959 per il suo lavoro sulla descrizione di un enzima, la DNA polimerasi che permette la replicazione del DNA, il giovane Roger ha pubblicato un articolo nel 2001 di notevole interesse per la comunità scientifica. Utilizzando la cristallografia a raggi X, la stessa tecnica usata per rivelare la struttura del DNA, il suo gruppo di ricerca ha potuto decifrare in modo dettagliato l’architettura dell’ enzima RNA polimerasi II.  Inoltre il suo gruppo di ricerca è riuscito a immortalare l’ RNA polimerasi II in atto, mentre produceva dell’ RNA da DNA. Equipaggiato di una pinza, una sella, una cerniera, una prua, un coperchio, un ponte, un imbuto e una mandibola, questo super enzima permette l’entrata della doppia elica del DNA vicino al sito catalitico attraverso la sua “mandibola”. I due filamenti del DNA si dividono, permettendo ai nucleotidi di RNA di allinearsi lungo il DNA attraverso un piccolo poro. La nascente molecola di RNA esce ad angolo retto prima di staccarsi e andare in cerca dei ribosomi che guidano la sintesi delle proteine.Sebbene molti scienziati hanno lavorano sulla trascrizione, nessuno prima di lui ha descritto in modo così dettagliato questo processo, portando evidenze cristallografiche. In effetti, l’ RNA polimerasi II fa parte di uno di quei numerosi e complessi eventi che sono necessari per liberare il DNA dai nucleosomi, un gruppo di histoni, che sono stati anche studiati in parte da Kornberg. Queste unità base della cromatina (mostrate come perle lungo un filo nella figura sopra), sono presenti nella maggior parte delle cellule enucleate, non nei batteri.

• Marijori Matze (Instituto Gregor Mendel, Vienna): strani casi di silenziamento genico sono stati scoperti in piante transgeniche un decennio precedente. Il suo gruppo di ricerca ha pubblicato nel 1989 un lavoro in cui piante di tabacco erano in grado di silenziare transgeni presenti in due copie mentre questo fenomeno non si verificava in piante con una sola copia.

• L’ anno seguente, un gruppo olandese e uno americano generavano contemporaneamente simili strani risultati, in una ricerca condotta con lo scopo di aumentare il colore dei petali della petunia. Piuttosto che aumentare il color viola del fiore della petunia, l’aumento del numero di copie del gene responsabile del colore del fiore provocava una splendida varietà di fiori, alcuni con sprazzi di viola su sfondo bianco altri completamente bianchi. Quando i ricercatori hanno esaminato i livelli di RNA espressi dal gene responsabile per il color viola, i fiori bianchi avevano un livello molto basso. Questo risultato ha portato alla conclusione che le copie in più del gene determinavano lo spegnimento del gene endogeno stesso.

• Altre importanti scoperte sono state compiute grazie a ricerche condotte in piante negli anni novanta. Verso la fine degli anni novanta, Fire e Mello, hanno cominciato a scoprire i meccanismi sottostanti questo misterioso sistema per spegnere i geni. Iniettando dell’ RNA a singolo filamento trascrivente il gene di un muscolo di un verme non hanno ottenuto alcun effetto e nemmeno quando hanno provato a iniettare dell’RNA a singolo filamento antisenso. Tuttavia quando hanno iniettato entrambi i filamenti di RNA senso e antisenso contemporaneamente, il verme ha cominciato a perdere tono muscolare. I due filamenti senso e antisenso di RNA, formavano un doppio filamento di RNA (dsRNA) che interferiva con la traduzione del gene del muscolo in proteina.

• Subito dopo, David Baulcombe e Andrew Hamilton (Centro John Innes, Norwich, UK) hanno apportato ulteriori elucidazioni su questo meccanismo. Hanno scoperto che il dsRNA veniva spezzato in piccoli frammenti (siRNAs) responsabili del silenziamento genico. In particolare il dsRNA viene tagliato da una proteina chiamata dicer. I piccoli RNAs diventano a singolo filamento quando si legano a complessi di proteine dai quali protrudono per trovare molecole di RNA complementari. L’ mRNA complementare che sta per venir tradotto in proteina, viene riconosciuto e degradato. In questo modo il gene viene inattivato.

• Sia in animali che in piante l’RNAi rappresenta una difesa naturale contro l’invasione da materiale genetico, sia introdotto artificialmente, come negli esperimenti citati, che in natura, attraverso l’infezione virale. Inoltre questo sistema rappresenta uno dei tre metodi per regolare il silenziamento genico durante lo sviluppo. Oltre al suo naturale ruolo, l’RNAi può avere un’ incredibile applicazione nel campo medico. Essere in grado di colpire e silenziare geni espressi erroneamente, rappresenta un’ enorme speranza per il trattamento di malattie a carattere genetico.

immagini, cartoons

easternblot.net
questa è un' immagine da Easternblot che  dà una visione immediata (un filo che si smaglia) di un cromosoma che si sfilaccia come il capo di un filo di una maglia, infatti il DNA è un doppio filamento di acidi nucleici  attorcigliato ad elica e raggomitolato in diverse strutture sempre più compatte

                                                                  cromosoma e DNA

in un post precedente abbiamo parlato del DNA, di come è formato, e di come la sua struttura a doppia elica sia stata confermata scientificamente con la cristallografia a raggi X (Dorothy Hodgkin ne fu una sviluppatrice), mentre Rosalind Franklin aiutò il gruppo di scienziati di Cambridge  in particolare Francis Crick per le sue acquisizioni sulla struttura del DNA che confermavano la presenza di una alfa elica, avvolta in due forme, "A" e  "B".

• Franklin and Gosling discovered that there were two forms of DNA: at high humidity (when wet), the DNA fibre became long and thin; when it was dried it became short and fat. These forms were termed DNA 'B' and 'A' respectively. She also specified the amount of water to be found in the molecule in accordance with other parts of it, data that have considerable importance in terms of the stability of the molecule.
• By January 1953, Franklin had reconciled her conflicting data and had started to write a series of three draft manuscripts, two of which included a double helical DNA backbone. Her two A form manuscripts reached Acta Crystallographica in Copenhagen on 6 March 1953, one day before Crick and Watson had completed their model. Franklin became angry when Watson suggested she did not know how to interpret her own data. Watson hastily retreated, backing into Wilkins who had been attracted by the commotion. Wilkins commiserated with his harried friend and then changed the course of DNA history with the following disclosure. Without Franklin's permission or knowledge, Wilkins showed Watson Franklin's famous photograph 51. Watson, in turn, showed Wilkins a pre-publication manuscript by Pauling and Corey.  Franklin and Gosling's photo 51 gave the Cambridge pair critical insights into the DNA structure. Franklin's research was completed by February 1953, ahead of her move to Birkbeck, and her data were critical. Model building had been applied successfully in the elucidation of the structure of the alpha helix by Linus Pauling in 1951. Since Franklin had decided to transfer to Birkbeck College and Randall had insisted that all DNA work must stay at King's, Wilkins was given copies of Franklin's diffraction photographs by Gosling. By 28 February 1953 Watson and Crick felt they had solved the problem.

• Franklin, and the research group she headed, focused on the structure of RNA, a molecule equally central to life as DNA. RNA actually constitutes the genome (central information molecule) of many viruses, including tobacco mosaic virus.

 Quindi, tornando al problema iniziale, la domanda è come fanno delle molecole lunghe e contenenti gruppi fostato,  con cariche negative sui carbossili e sugli ioni fostato, a rimanere compatte e a non respingersi tra loro, e quali analisi fisiche e chimiche hanno permesso di trovare la soluzione a queste domande
La presenza di cariche positive sugli ammino acidi lisina e arginina, nelle proteine istoniche, e la formazione di legami elettrostatici con i gruppi fosfato riesce a neutralizzare la tendenza a respingersi insita nel filamento di DNA e dell'RNA virale. 

Come in un nucleo atomico non sarebbe possibile tenere insieme diversi protoni carichi, altrettanti neutroni e gli elettroni con cariche opposte ai protoni, se il numero di queste cariche elettriche non fosse bilanciato (e formati dalle diverse particelle di varia natura, alla base della fisica quantistica)
 Inoltre, seguendo le leggi della termodinamica, l'entropia è la tendenza di un sistema a passare da uno stato  ordinato ad uno disordinato, quindi senza fornire energia l'entropia tenderebbe ad aumentare. In un nucleo, occorre fornire energia, in termini di ATP idrolizzato, per mantenere la struttura del DNA compattata (grazie agli enzimi topoisomerasi e girasi).

Il DNA è un polimero lunghissimo. Il genoma umano contiene più di un miliardo di lettere (nucleotidi)
Dal sito Treccani:

• Quanto è lungo il DNA di una cellula?

Nell'uomo il codice genetico è formato da circa tre miliardi di nucleotidi; poiché la distanza media tra due nucleotidi successivi in un filamento è dell'ordine di circa 0.2 nanometri (nm; 1 m = 1 miliardo di nm), il DNA contenuto in ogni cellula ha una lunghezza di circa 1 m ed è spesso solo 2 nm. Per poter essere contenuto in una cellula grande 10 micron (1m = 1 milione di micron) questo lunghissimo filamento deve necessariamente ripiegarsi su se stesso e formare strutture di complessità crescente che siano adatte a mantenerlo in forma compattata, con una lunghezza pari a circa 500 milioni di volte il suo diametro.

Poxvirus: vaccinia virus (virus del vaiolo). L'informazione genetica è contenuta in un filamento a DNA singolo di dimensioni notevoli, come è stato oservato grazie al microscopio elettronico, che non sfrutta la luce come sorgente di radiazioni ma un fascio di elettroni.
The virion is exceptionally large, its size is around 200 nm in diameter and 300 nm in length and carries its genome in a single, linear, double-stranded segment of DNA.


Nucleo (1)

 I nuclei, i mitocondri, i cloroplasti sono strutture proteiche e lipidiche che racchiudono spazi interni in cui sono contenuti e compressi filamenti di DNA e RNA. 
I nuclei, i mitocondri e i cloroplasti si isolano grazie alla centrifugazione in gradiente di densità, che dopo un certo tempo permette a strutture dello stesso peso di stratificarsi sullo stesso livello di una provetta. In soluzioni di glucosio, saccarosio o mannitolo a diverse concentrazioni, certi organelli arrivano sul fondo della provetta ed altri no, in presenza di cloruro di cesio 6 Molare,  DNA cromosomici e plasmidici (colorati con etidio bromuro) sono visualizzati agli UV come bande sospese e aspirati con una siringa.
Un metodo per estrarre il DNA da un organello è la sospensione in soluzioni iperosmotiche, che determinano la rottura della membrana. La presenza di sali  caotropici e agenti denaturanti come il guanidinio cloruro e guanidinio tiocianato permette poi l'allontanamento delle proteine, perchè rompono le interazioni idrogeno, ioniche e quelle idrofobiche, e sono usati per la purificazione degli acidi nucleici, in particolare dell'RNA.
L'eucromatina è l'organizzazione spaziale del DNA che è accessibile alle proteine e quindi viene trascritta, mentre l' eterocromatina, è una struttura silenziata perchè bloccata da complessi proteici di repressione

il DNA è un doppio filamento avvolto su una scaffalatura di  istoni (nucleosoma) che impacchetta il DNA in diversi ordini di grandezza (nucleosomi, bande di filamenti solenoidi) che riesce così a essere contenuto in 23 coppie di cromosomi nel nucleo della cellula (superavvolgimento).

Ad esempio, il cromosoma 1 nell'uomo contiene 220 milioni di coppie di nucleotidi.

questo post vuole essere un contributo al Carnevale della Fisica #23 di settembre, dal tema "L'infinitamente grande e l'infinitamente piccolo", ospitato sul blog Scientificando di Annarita Ruberto, che apprezzo per i suoi contributi sulla comunicazione della Scienza e dell'insegnamento delle scienze, vedi Matematicamente e altri argomenti e raccoglitori...

e infine, questo cartoon tratto dal sito xkcd

blog

 a proposito di blogs, e di comunicazione, si può visionare il contenuto del sito avanzando il tasto Next o quello random... bellissime vignette.....