Conclusione degli stages con gli studenti di liceo

Dopo la pausa primaverile, le attività extracurriculari degli studenti del quarto anno sono riprese a maggio, per finire a giugno a lezioni concluse, per un totale di 4 settimane, e 100 ore presso il laboratorio. Ecco una sintesi delle attività trattate.

Presentazioni powerpoint e attività finali

Memoria degli stress, epigenetica e modificazioni post-traduzionali

Il mantenimento di marcatori epigenetici (marcature su istoni), microRNA e DNA metilato si può trasmettere nella progenie e da un anno all’altro rende la pianta meno sensibile a nuovi stress

Anche RNA lunghi svolgono un ruolo importante nel controllo dell’eucromatina, formando strutture leganti complessi repressivi e enzimi modificanti. In particolare il controllo della vernalizzazione è regolato da questi complessi, che scompaiono in primavera permettendo l’aumento di FLC, Flowering Locus C, che viaggia verso l’estremità dei rami e attiva la produzione dei fiori.

Nei legumi, piante modello come l’erba medica e piante di importanza alimentare come il cece sono state studiate varietà sensibili e resistenti a stress salino e idrico. Nelle radici delle varietà resistenti si produce più acido jasmonico e in tempi rapidi. La qualità “attivazione precoce” nelle radici è misurabile ed è stata dimostrata sui geni responsabili con primers specifici e con amplificazione PCR (reazione polimerasica a catena). Abbiamo presentato i nostri risultati sull'importanza di una attivazione precoce della biosintesi di acido jasmonico, con alcune nuove pubblicazioni sul ruolo dell'ossido nitrico, catalizzatore di attività enzimatiche e di fattori di trascrizione importanti in questo pathway, e  dell'acido abscissico, attivatore di microRNAs, di enzimi modificanti gli istoni, e regolatore dello stato metilato del DNA, nella memoria degli stress.

Attività svolte nello stage:

Modulo 1.             Il suolo: composizione chimica, proprietà, cicli degli elementi, compostaggio, Interazione radice- suolo, Interazione pianta-batteri e funghi, ormoni, priming chimico e modulazione delle vie di segnale di ormoni: Acido Jasmonico, Acido Salicilico, Etilene, Auxina. Valutazione di prove sperimentali in campo per misurare effetto di diversi fertilizzanti organici. Valutazioni della quantità e resa di raccolti comparando l’applicazione di fertilizzante organico liquido, letame animale, biomasse vegetali rivoltate nel suolo, su diverse tipologie di raccolto: grano tenero, legumi, patate, mais, diversa richiesta di azoto, potassio e fosforo.

Modulo 2.             L’ambiente e le piante: introduzione al problema, Interazione pianta-ambiente, cambiamenti climatici, anidride carbonica, stress ambientali, radici di varietà resistenti e produzione di Acido Jasmonico in tempi rapidissimi attivano segnali di adattamento. Interazione con segnali dipendenti da Acido Abscissico. Caratteri favorevoli a resistenza a stress: apparato radicale lungo e sviluppato; precocità della fioritura.

Modulo 3.             adattamento e memoria degli stress, patrimonio genetico e differenze varietali, epigenetica e memoria degli stress, modificazioni post-traduzionali delle proteine, marcatura di istoni e accessibilità della cromatina, complessi di repressione dell’espressione genica, non-coding RNA nel controllo della vernalizzazione e della fioritura.

Modulo 4.             Specie vegetali selvatiche e coltivate. Adattamento varietale a differenti condizioni ambientali. Solanaceae: patata, pomodoro, peperone. Varietà di fenotipi nelle specie coltivate e differenze tra varietà selvatiche e coltivate. Solanum tuberosum: patate gialle, rosse, variabilità nella resistenza a malattie fungine (carestia irlandese e nuovi incroci); Solanum lycopersicum: pomodoro con varia forma e consistenza, San Marzano, Pachino, estivo e invernale; sensibilità a malattie virali. Capsicum annuum, C. baccatum, C. frutescens, C. cinense e C. pubescens: peperoncini e contenuto differente in capsaicina e pirazina, organi di sintesi, molecole coinvolte nella piccantezza e nella aromaticità. Il cacao: due varietà principali e un incrocio tra queste all’origine di tutta la produzione di cioccolato. Espressione di caratteri varietali: Vite: uva da tavola, da vino rosso e bianco, tannini, resistenza a funghi e patogeni: incrocio con vite americana. Petunia: variabilità dei colori nei fiori legata a fattori di trascrizione che attivano la sintesi dei pigmenti (antociani), effetto variegato, silenziamento genico e RNA interferenza.. Mais. Geni saltatori: variabilità del colore dei chicchi di mais e mobilità dei retrotrasposoni, elementi di DNA di origine virale.

Modulo 5.             I polisaccaridi, zuccheri complessi. Studio di idrolisi di amido di patata (Buccia e polpa, a diverso contenuto di amilopectine); Idrolisi acida con acido cloridrico al 5%; Idrolisi basica con idrossido di sodio al 5%. Quantificazione degli zuccheri liberi (kit enzimatico) e del precipitato insolubile (portato a secco, pesatura con bilancia). Applicazione di zuccheri solubili nei terreni di crescita di batteri, valutazione velocità di crescita.

Modulo 6.             Nutrizione: proteine come fonte di amminoacidi essenziali e non. Meccanismo di attività delle proteasi. Riconoscimento dei siti di taglio. Proteasi nella digestione animale. Proteasi nella produzione di cagliata, industria casearia. Proteasi e inibitori delle proteasi nella coagulazione del sangue. Inibitori di proteasi nei legumi e necessità di cottura per denaturarli. Proteasi i inibitori delle proteasi nel seme, e ruolo nella germinazione. Proteasi fungine e batteriche e difesa da parte delle piante con inibitori di proteasi e galatturonasi.

Modulo 7.             Chimica in cucina. Nutrizione e fattori anti-nutrizionali. Vitamine complessate. Niacina nella farina di mais. Preparazione della farina per idrolisi alcalina libera niacina nella tortilla messicana. Polenta e carenza di niacina (vit. PP, previene pellagra). Biotina e albume, effetto denaturante della cottura sui fattori anti-nutrizionali. Additivi chimici. Emulsionanti, lecitine e maionese. Ciclodestrine con cavità interna che stabilizza molecole tendenti ad ossidarsi (carotenoidi, tocoferoli), uso nelle bevande e nelle salse. Addensanti e gelificanti: gelatina, agar, carragenani, farina di carrube. Potere calorico di lipidi, proteine e zuccheri. Dose giornaliera raccomandata. Stabilizzanti e conservanti: nisina, acido sorbico, pH acido. Coloranti alimentari: antociani, flavonoidi.

Modulo 8.             Laboratorio di Elettromagnetismo: spettro elettromagnetico, onde radio, etichette per identificazione in RadioFrequenza (RFID), tracciabilità delle produzioni industriali, Metamateriali e indossabilità di sensori, Pace-Makers. Visite guidate. Orto Botanico, e riconoscimento di piante aromatiche e alberi da frutta locali. Museo dell’Ambiente: fossili di varie epoche preistoriche, dal Cretaceo, circa 60 milioni di anni fa, nella pietra dura, chianche; e nel carparo, pietra leccese più morbida e porosa, più recente. 

Esperimenti pratici in laboratorio

Misure sperimentali ed analisi dati. Siero di latte: piastramento su agar per conta batterica totale, e su terreni specifici per batteri lattici, preparati al momento. Dopo due giorni hanno contato le colonie, e comparato i risultati ottenuti da ognuno facendo la media delle conte batteriche (variabilità originata da possibili errori di prelievo dei volumi)

Attività pratiche

Biologia molecolare

Allestimento di reazione di Amplificazione del DNA. 

PCR, Reazione polimerasica a catena, Polymerase Chain Reaction) in tubi eppendorf da 0,2 ml in Termociclatore. Taq Polimerasi enzima termotollerante, lavora a 72° C. Diluizione di DNA a concentrazione nota, aggiunta di soluzione salina tampone, nucleotidi ATP, CTP, TTP; GTP, i primers, corte sequenze di DNA a singlo filamento specifiche per il gene d interesse, la Taq polimerasi, in un volume finale di 30 microlitri. Termociclatore e programma di impostazione delle temperature: allineamento dei primers (55° C); estensione del filamento 72° C; denaturazione del DNA 94° C. Preparazione del Gel di agarosio: Ogni studente ha caricato con pipettatore 10 microlitri di campione mischiato con soluzione di  maggiore densità (con glicerolo e colorante) in un pozzetto del gel. Corsa elettroforetica a corrente e voltaggio costante – migrazione dei campioni visualizzata dalla presenza del colorante. Visualizzazione del DNA sul gel al trans-illuminatore (UV), acquisizione dell’immagine.

Messa a punto di saggio di attività proteasica.

Ogni studente ha preparato la propria provetta e aggiunto volumi differenti di pepsina, substrato (1: azocaseina per la lettura allo spettrofotometro e 2: caseine per la corsa su gel di acrilammide) e una soluzione tampone a pH 2.

1. Determinazione della densità ottica della soluzione contenente proteasi (pepsina) ed azocaseina.

Letture allo Spettrofotometro: durante la digestione gruppo azo viene eliminato, la colorazione arancione diminuisce con una correlazione proporzionale all’attività della proteasi.

2. Caseine incubate con pepsina. Separazione delle proteine mediante elettroforesi su gel di acrilammide (SDS-PAGE); colorazione delle bande proteiche con Blue Coomassie, meno sensibile, e con nitrato di argento. Le caseine si sono colorate con nitrato di argento, con una stima di concentrazione pari a 5 nanogrammi. Il controllo di caseine colorato con Blue Comassie corrisponde a 50 nanogrammi

 Sperimentazioni  biochimiche

Studio di idrolisi di amido di patata 

Siamo partiti da buccia e polpa, a diverso contenuto di amilopectine. Idrolisi acida con acido cloridrico al 5%; Idrolisi basica con idrossido di sodio al 5%; Quantificazione degli zuccheri liberi (kit enzimatico) e del precipitato insolubile (bilancia). Applicazione degli zuccheri solubili in terreno di crescita di batteri, valutazione velocità di crescita

Estrazione di oli, composti lipidici carotenoidi e tocoferoli da tessuti vegetali (oliva, germe di grano, semi di zucca)  

Recupero della fase oleosa nel solvente più adatto (etanolo, metanolo, esano): purificazione per evaporazione del solvente mediante evaporatore rotante. 

Studio della stabilità nel tempo, valutazione della ossidazione di lipidi e carotene. Stabilizzazione mediante ciclodestrine (anelli circolari di polisaccaridi a 7 unità, con dimensione della cavità adatta a lipidi di piccola e media dimensione). Utilizzo industriale delle ciclodestrine: in bevande, deodoranti, salse, ecc…

Visualizzazione delle separazioni dei composti lipidici mediante cromatografia liquida HPLC su colonna idrofobica e capillari ad alta pressione (High Performance Liquid Chromatography). Principi di visualizzazione dei picchi sulla base di assorbanza nel visibile e nell’UV con luce monocromatica (210 nm, 280 nm, 340 nm, 450 nm)

 Diario di bordo

Ad ogni fase di avanzamento delle esperienze, è seguita la verifica del processo di apprendimento e discussione. Gli studenti hanno documentato i vari metodi, le analisi e i risultati ottenuti mediante foto, materiale acquisito da libri e diapositive fornito dai tutor e discusso con i tutor il significato e le ragioni alla base delle tecniche messe in pratica e delle dimostrazioni svolte.