Campeggio, periodico, acido, colorazioni, PAP test

Il campeggio, o campeccio è una leguminosa (in greco: Legno di sangue, in inglese logwood, bloodwood) del centro-America, che cresce ad albero sempreverde raggiungendo anche i 10 metri.

 Già nota agli aztechi, che ne estraevano un colorante (rosso in ambiente acido e azzurro in ambiente alcalino), Ematossilina, fu sfruttata dagli spagnoli dopo la Conquista per l'industria dei tessuti.  Questo colorante è utilizzato in istologia per colorare di blu i nuclei e, insieme all'eosina, per colorare i compartimenti cellulari. I componenti cellulari carichi negativamente si fissano all'emateina e sono detti basofili, mentre alcuni comparti come il mitocondrio, le proteine basiche ed il collageno, carichi positivi, legano l'eosina (eosinofili o acidofili) colorandosi di rosso rosato.

•La prima applicazione biologica  dell'ematossilina è stata descritta da Bohmer  nel 1865. Prima di essere usata per colorare i nuclei l'ematossilina viene ossidata e emateina, combinata con un mordenzante (ioni metallici come i sali di alluminio e di ferro), possiede carica positiva e colora DNA e proteine acide, come la fosfatasi acida, colorando i nuclei di blu porpora.  

   

 Il test di Papanicolau è utilizzato per individuare cellule esfoliative in campioni citologici, cellule che hanno perso le proprietà di adesione (ossia l'inibizione da contatto, la proprietà delle cellule appartenenti ad un tessuto di mantenere il loro ruolo nell'insieme tessutale ed il compattamento ordinato all'interno della struttura sociale). I principi della colorazione

Essa si basa sulla combinazione di una colorazione nucleare (a base di ematossilina) e di due contro-colorazioni citoplasmatiche (a base di OG-6 e EA-50):

Il primo, l’OG-6 (Orange G) colora la cheratina dall’arancio brillante al giallo;

Il secondo, l’EA, è invece una miscela di due coloranti: Eosina e Verde Luce. La prima delle due colora il citoplasma delle cellule pavimentose mature superficiali di rosa, dette eosinofile. Il Verde Luce, invece, colora il citoplasma delle cellule più immature (para-basali o basali) di verde-celeste dette cianofile

Una volta fissate le cellule mediante una miscela di etanolo assoluto ed etere etilico, i passaggi per effettuare la colorazione sono i seguenti:

NUCLEI: il vetrino passa in alcool a concentrazioni decrescenti fino ad acqua distillata, poi si aggiunge ematossilina di Harris per 2-8 minuti, che colora i nuclei in blu-viola;

Si lava con acqua distillata e poi con acqua di fonte per scaricare il colore in eccesso;

CELLULE MATURE: si passa il vetrino nell’Orange G per 5-6- minuti e poi si effettuano 2 passaggi in alcool 95%, per colorare le cellule mature;

CELLULE SQUAMOSE: si passa poi il vetrino nel colorante EA-50 (per gli strisci vaginali) e di nuovo si effettuano 2 passaggi in alcool 95%, per colorare le cellule squamose;

In ultimo si fanno 2 passaggi in alcool assoluto e infine in xilolo e balsamo.

La formulazione di Gill No. 1 è usata in colorazioni citologiche progressive; le formulazioni di Gill  No. 2 e No. 3 possono essere usate come colorazioni progressive o regressive in funzione della lunghezza del tempo di esposizione del vetrino.

Papanicolaou Stain OG-6

Catalogue No. HT40-1, certified orange G, 0.3 % w/v, phosphotungstic acid, 0.015 % w/v, in denatured alcohol.

Papanicolaou Stain EA-50 

Catalogue HT40-3, certified eosin Y, 0.23 % w/v, certifiedfast green FCF, 0.08 % w/v, certified bismark

brown, 0.05 %, phosphotungstic acid, 0.2 % w/v, in denatured alcohol.

Gill’s 2 Hematoxylin Solution

Catalogue No. GHS-2, certified hematoxylin, 4g/L, sodium iodate, 0.4 g/L, aluminium sulphate, 35.2 g/L

and stabiliser (Glicole).

Procedure

1. Fix slides in 95 % alcohol for 15 minutes.

2. Rinse in tap water.

3. Stain in Gill’s Hematoxylin No. 2 solution for 1 to 3 minutes.

4. Rinse in tap water.

5. Dip slides 10 times in working Scott’s Tap Water Substitute.

6. Rinse in tap water.

7. Dip slides 10 times in 95 % alcohol.

8. Stain in OG-6 solution for 1.5 minutes.

9. Dip slides 10 times in 95 % alcohol.

10. Stain in EA-50 solution for 2.5 minutes.

11. Dehydrate in 2 changes of 95 % alcohol.

12. Dehydrate in 100 % alcohol for 1 minute.

13. Clear in 2 changes of xylene and coverslip with mounting media. 

•Il PAP test permette  di individuare lesioni precancerose nella saliva, nei liquidi biologici e nei prelievi cervical.

In generale,le cellule sono fissate su un vetrino, trattate con il colorante dei nuclei e controcolorate con un miscuglio di orange G, eosin Y and fast green FCF (sostituisce• il colorante verde chiaro  SF).

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Colorazione PAS : Acido Per-iodico

Periodic Acid-Shiff’ colorazione PAS con Mucicarminio - 

Metodo per colorare i polisaccaridi e i protein-glicani, glicogeno, e la mucina, nei tessuti e nelle membrane basali dell'epitelio, sugli strisci di sangue: è un colorante basofilo che lega cariche negative, sviluppa un colore porpora-magenta. Come fissativo si usa il metanolo (o la formalina neutra).    

    

 All'inizio di maggio, sono venute in Italia due giovani colleghe da Mosca, e oltre a condividere esperienze e tecniche  di laboratorio, abbiamo parlato del corso di laurea di Medicina, confrontando la loro con la mia esperienza (biennio all'univeristà di Torino, e l'esame di Anatomia, le sezioni di cervello in formalina, lo studio delle ossa, il cranio, e i vetrini con  tutti i diversi tipi di tessuto. all'esame, la prova di identificazione del vetrino al microscopio, con il bidello che suggeriva la soluzione ai più assidui frequentatori dei laboratori didattici.

Dopo, un altro Istituto che è stato importante, Microbiologia, con esperienze di fissaggio dei vetrini, preparazione di terreni di coltura agarizzati, nei provettoni, l'uso delle anse di platino per strisciare l'agar.

  

TSI Agar: Triple sugar iron agar

A sinistra, il tubo non contiene batteri, nel secondo tubo  si evidenzia la tipica reazione in presenza di E. coli  

E. coli è un batterio aerobo, a bastoncello, mobile, Gram-negativo  che fermenta lattosio e altri zuccheri

 Fermentando glucosio produce diversi acidi(lattico, formico) e diventa  visibile perchè il colorante indicatore rosso metile si colora in ambiente acido.

Nella caratterizzazione di ceppi batterici, si fa uso di metodi biochimici per fenotipizzare gli enzimi presenti, catalogando i ceppi secondo gli enzimi presenti e raggruppandoli in modo da identificare la specie (API test)

Voges-Proskauer test: permette di identificare acetoino e 2,3-butanediolo prodotti da Klebsiella e Enterobacter quando fermentano il glucosio. In condizioni alcaline, acetoino e butandiolo si ossidano a diacetile, che reagisce con creatina formando una colorazione rossa-rosata, e reagisce con naftolo formando un colore rosso ciliegia.

reagente di Kovac’s (DMCA) per la Triptofanasi che degrada l'amminoacido triptofano in piruvato, indolo, e ammoniaca;  si rileva la produzione di indolo (colore rosso).

β-Galattosidasi: si rileva con  ONPG (2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside), substrato cromogenico che vira a giallo  dopo il taglio enzimatico.

Abilità a ridurre  nitrati a nitriti: si esegue con l'aggiunta di acido sulfanilico e  β-naftilammina, che risulta in un precipitato rosso.

La lisina è degradata  da E. coli in cadaverina con l'enzima lisina decarbossilasi in una rezione alcalina, che si evidenzia con l'indicatore rosso bromocresolo che cambia colora da giallo a porpora.

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